Спектральные диапазоны спектрофотометров унифицированы: они работают в четко определенной части спектра: например, ИК, УФ, Вид либо УФ/Вид. Также однозначно можно выбрать значения таких параметров измерений, как длина оптического пути, время проведения измерения и т.д. Но с разрешением и шириной спектральной щели не все так однозначно. Здесь мы часто сталкиваемся с двумя распространенными мифами:
- Миф 1: нормативные документы требуют использования спектрофотометра с шириной полосы пропускания 1,0 нм
- Миф 2: чем меньше ширина полосы пропускания, тем точнее результаты
В данной статье мы постараемся развенчать эти два мифа, разобравшись в определениях «Спектральная полоса пропускания» и «Разрешение». Также будут рассмотрены нормативные требования к этим характеристикам в фармацевтике согласно Фармакопеям США (USP), Европы (EP), Великобритании (BP), Украины (ДФУ).
Чтобы разобраться с ситуацией, нужно погрузиться в теоретические аспекты получения спектров и работы приборов.
Что такое спектральная полоса пропускания?
Свет бывает разным: лучи солнца, свет фонарика, солнечный зайчик, свет свечи. Во всех перечисленных случаях свет представляет собой комбинацию из разных длин волн (здесь нужно вспомнить эксперимент с призмой, разлагающей белый свет в спектр, что подтвердит это высказывание).
В случае со спектрофотометром измерение проводится при четко определенной длине волны, выделить которую помогает монохроматор. Но и здесь почти каждый из нас представляет упрощенную картину: даже после монохроматора на образец не попадает четкий яркий луч света – попадает свет с гауссовым распределением.
Для наглядности полная картина приведена на рис. 1. Пользователь устанавливает длину волны λ1 (пунктирная вертикальная), но на образец попадает излучение с распределением интенсивности, показанным черной сплошной линией. Измерения проводят, исходя из предположения, что эти линии совпадают. Но на практике, как видно из графика, это не так и вносит некоторую погрешность в измерения.
Но как же оценить положение условной линии? Рассчитывать площадь под графиком? Делать дополнительные измерения?
Ответ прост и однозначен:
- Вычислить ширину пика на половине его высоты (подобные вычисления делают при обработке хроматограмм).
- Построить треугольник с вершиной на установленной длине волны.
Таким образом мы получаем два основополагающих понятия: в первом случае – спектральной полосы пропускания (красные линии λSB ), во втором – ширины щели (синие линии λSSW).
Значение спектральной полосы пропускания спектрофотометра зависит от оптической схемы прибора и не регламентируется ни одним нормативным документом, тогда как ширина щели упоминается в Фармакопеях.
Что такое разрешение?
Во многих рекламных роликах анестетиков нам рассказывают о боли. Она бывает острой, тупой, режущей, колющей, периодической. В последнем случае болевые ощущения то усиливаются, то ослабевают, причем если боль нарастает, то мы уже не может выделить пики и воспринимаем такой болевой синдром как сплошной приступ.
Теперь прошу вас выдохнуть и улыбнуться. Это была всего лишь аналогия. Так вот, если представить, что наш мозг – детектор, а болевые приступы – волны, то разрешением можно назвать минимальное время между волнами, которое наш мозг способен различить.
По аналогии спектральное разрешение – это минимальная разность между частотами (длинами) двух монохроматических волн излучения, при которой они могут быть разделены (разрешены) в спектре.
Как всегда, Фармакопеи устанавливают эталон, который позволит верно оценить разрешение разных приборов (если мы вернемся к нашей неприятной аналогии – стоит ли оценивать мозг по восприятию зубной боли или боли в ноге). Стандартом для проверки разрешения спектрофотометра является 0,02% раствор толуола в гексане. Разрешающая способность спектрофотометра рассчитывается с использованием соотношения между максимумом и минимумом поглощения стандартного раствора.
Что указано в документации?
- USP. В <851> USP (Spectrophotometry and Light Scattering) не приведены особые требования.
- EP (Ph. Eur.). Текущая версия EP не содержит каких-либо требований к спектрофотометрам в отношении спектральной полосы пропускания. Однако ЕР включает требования по контролю разрешения спектрофотометра и выбору ширины щели при использовании спектрофотометра с переменной шириной щели. В методе <2.2.25> эти требования описаны аналогично ДФУ.
Насколько известно, единственной монографией, которая в настоящее время указывает требуемое разрешение для спектрофотометра, является монография 0113 для калиевой соли бензилпенициллина. Эта монография определяет разрешение, равное не менее 1,7.
- BP. Издание Британской Фармакопеи 2008 года ссылается на метод <2.2.25> EP. В рамках ВР конкретные монографии предписывают использование спектрофотометра с полосой пропускания <2,0 нм.
- ДФУ. В разделе <2.2.25> описаны следующие требования к разрешению и ширине спектральной щели (далее – цитаты):
«Разрешение (для качественного анализа): Если указано в монографиях, то определяют разрешение спектрофотометра таким образом. Записывают спектр 0,02% (об/об) раствора толуола Р в гексане Р. Минимально допустимое значение отношения оптической плотности в максимуме поглощения при 269 нм к оптической плотности в минимуме поглощения при длине волны 266 нм указывают в монографии. Также могут быть использованы подходящие стандартные материалы.Ширина спектральной щели (для количественного анализа). В случае использования спектрофотометра с переменной шириной спектральной щели при выбранной длине волны возможны погрешности, связанные с шириной этой щели. Для их исключения ширина спектральной щели должна быть малой в сравнении с полушириной полосы поглощения и в то же время должна быть максимально большой для получения высокого уровня Io. Следовательно, ширина щели должна такой, чтобы дальнейшее ее уменьшение не изменяло величину измеряемой оптической плотности».
Таким образом, и Миф 1 и Миф 2 развенчаны: требования по ширине оптической щели не являются решающим критерием при выборе измерительного прибора. Главное в анализе – точность результатов и верный выбор параметров и условий проведения измерений.
Но если прибор в лаборатории только один? Как его адаптировать для работы с разными образцами? Решением является прибор с переменными параметрами, а именно – шириной полосы пропускания.
Спектрофотометр с изменяемой шириной полосы пропускания.
В чем преимущество?
Прибор с переменной шириной спектральной щели – решение универсальное. Поэтому прежде всего на него стоит обратить внимание лабораториям, которые выполняют тесты в соответствии с требованиями нескольких нормативных документов: таким образом можно сэкономить средства и оптимизировать пространство лаборатории. Но, как всегда, не обходится без ложки дегтя – не стоит забывать о том, что уменьшение ширины полосы пропускания приводит к уменьшению интенсивности луча и, следовательно, количества излучения, попадающего на образец. Это влечет за собой снижение:
- Точности и воспроизводимости результатов
- Пределов обнаружения
- Точности количественного определения
- Надежности метода
То есть мнение о том, что при использовании минимального значения ширины щели можно получить более точные результаты (что позволяет использовать единое значение даже для экспериментов с рекомендуемым большим значением), не всегда верно.
На иллюстрациях приведены результаты измерений двух образцов при разных значениях ширины спектральной полосы пропускания (0,5, 1,0, 1,5, 2,0 и 4,0 нм). Для пиков, выделенных из всего спектра, вычисляли соотношение «сигнал-шум» и строили общий график. Это наглядно показывает, что ширину полосы пропускания следует определять для каждого типа образцов индивидуально. Комментарии см. в подписи к рис. 2.
Спектрофотометр – «рабочая лошадка» в любой лаборатории: часто без него невозможно проведение контроля качества ни сырья, ни готового продукта. И на первый взгляд может показаться, что проще всего отдать предпочтение прибору с наиболее распространенными параметрами, ведь не могут же все производители ошибаться. В случае с шириной спектральной щели наиболее распространенным является значение 1 нм.
Как показывает практика, более узкая спектральная полоса пропускания улучшает разрешение близко расположенных пиков, она также уменьшает соотношение «сигнал/шум». Поэтому оптимальное значение ширины спектральной полосы пропускания следует выбирать, опираясь как на требования Фармакопеи, так и на особенности эксперимента и исследуемого вещества. Специалисты компании «ХИМЛАБОРРЕАКТИВ» смогут Вам помочь решить эту задачу.
Удобно, когда лаборатория имеет возможность выбирать нужное значение: например, так, как это реализовано в приборе Libra S80: из значений 0.5, 1.0, 2.0 и 4.0 нм. Данный прибор производится в Великобритании компанией «Биохром». Все приборы разрабатываются совместно с Кембриджским университетом, то есть каждый пользователь может быть уверен в том, что схема прибора не только надежна, но и прошла испытания в условиях исследовательской лаборатории. С полным ассортиментом компании вы можете ознакомиться здесь.