ООО «Химлаборреактив» – ведущий поставщик лабораторного оборудования в Украине. В партнерстве со многими мировыми производителями мы гарантируем инновационные решения, отвечающие международным стандартам. Сотрудничество с ХЛР – это всегда широкий ассортимент продукции, профессиональный сервис и экспертность специалистов компании, а значит, квалифицированная поддержка в выборе оборудования, его обслуживании и обучении персонала.
Вызовы в сфере фармисследований
Среди важных направлений деятельности ХЛР – обеспечение фармацевтической отрасли современными приборами, в частности, системами аналитического оборудования для жидкостной хроматографии. Сфера фармацевтических исследований и разработок сегодня развивается стремительно, так что хроматографические методы незаменимы для анализа и контроля качества, ведь помогают более глубоко и обоснованно подходить к интерпретации результатов анализов.
Например, серьезным вызовом может стать разделение пиков хроматограммы – в первую очередь из-за сложности анализируемых образцов. Они часто содержат несколько соединений, которые могут коэлюировать, а это приводит к перекрытию пиков и существенно затрудняет количественное определение и идентификацию. Для эффективного разделения этих пиков нужны два условия, которые бывает трудно выполнить: достаточная квалификация персонала (специализированные знания и опыт в хроматографических методах), а также, конечно, время.
Рециркуляционная хроматография
Прекрасным решением для разделения двух пиков может стать рециркуляционная хроматография. Это интересный метод для разнообразных применений, объединяющий их в общей задаче – отделении трудноразделяемых веществ. Общий принцип для всех подходов подразумевает, что частично разделенные аналиты несколько раз перенаправляются через колонку. Это имитирует нескончаемую длину колонки. А воспользоваться всеми этими опциями можно благодаря жидкостным хроматографам от KNAUER – немецкого производителя систем аналитического оборудования, которого в Украине эксклюзивно представляет компания «Химлаборреактив».
Далее будем говорить об образцовой смеси двух стевиолгликозидов, но можно привести и другие примеры, такие как разделение хиральных соединений. Этот принцип также может использоваться в препаративной хроматографии для достижения более высокой чистоты соединений, несмотря на загрузку большего количества образца по сравнению с однократным пролетом. Общий принцип рециркуляционной хроматографии заключается в многократном перенаправлении интересующих нас пиков через колонку. Так имитируется нескончаемая длина колонки, и как результат мы имеем лучшее разрешение целевого пика.
Рассмотрим два метода рециркуляционной хроматографии для лучшего разделения пиков.
Метод с рециркуляцией элюента
В классическом методе – с рециркуляцией элюента – перед входом насоса устанавливается Т-образный переходник и соединяется с многопозиционным клапаном, который выполняет функцию клапана фракционирования и расположен после детектора (рис. 1). Далее вводится образец с помощью двухпортового шестипозиционного инжекторного клапана, а клапан фракционирования переключается в положение рециркуляции. Образуется замкнутый контур. Интересующие нас соединения перенаправляются в основной поток с помощью Т-образного фитинга. Пройдя главный насос, соединения снова разделяются на стационарной фазе. Цикл повторяется, пока не будет достигнуто целевое разрешение или расширение пика не будет препятствовать дальнейшей рециркуляции. После каждого из циклов вещества выявляются детектором, который оценивает степень разделения. В результате целевые вещества могут быть собраны с помощью клапана фракционирования.
 |  |
Метод с использованием крана переключения колонок
Этот метод помогает избежать перенаправления потока через основной насос – используется вторая колонка идентичных размеров и еще один двухпозиционный шестипортовый клапан (рис. 2) в функции клапана рециркуляции. Колонки соединены так, что целевые соединения, выходя из первой колонки, попадают во вторую. Переключением клапана рециркуляции соединяется выход второй колонки со входом первой.
Подобно методу классической рециркуляции, через насос этот цикл переключения повторяется до достижения целевого разрешения или пока расширение пика не превысит один объем колонки. Время переключения клапана рециркуляции должно определяться заранее. Для этого выполняется один цикл с одной колонкой, чтобы понимать время содержания целевых соединений. В отличие от предыдущего метода, здесь детектор находится вне контура рециркуляции, так что разрешение целевого соединения проявляется по завершении разделения. Соответственно, процесс нельзя контролировать в режиме онлайн, если нет второго сенсора. Для фракционирования после детектора подсоединяют многопозиционный клапан или коллектор фракций. Рециркуляцию растворителя можно проводить по обоим методам. Но метод рециркуляции через насос работает в замкнутом контуре, а для метода альтернативной перекачки требуется клапан фракционирования и пороговая функция для рециркуляции растворителя. Для сравнения эффективности обоих методов рециркуляции известный препаративный метод ВЭЖХ (VFD0170 и VFD0171) для разделения ребаудиозида А и стевиозида был масштабирован до полупрепаративного масштаба.
Готовим образцы
Базовый раствор с содержанием 10 мг/мл стевиозида и 10 мг/мл ребаудиозида А готовится с использованием 30:70 ацетонитрила / дистиллированной воды (об./об.) в качестве растворителя. Основной раствор разбавляется в соотношении 1:50 с раствором 30:70 ацетонитрила / дистиллированной воды (об./об.), чтобы добиться целевой концентрации 0,2 мг/мл для каждого соединения. Образец фильтруется через RC-мембрану на 0,45 мкм (регенерированную целлюлозу) перед инжекцией.
Изучаем результаты
Результат метода рециркуляции изображен на рис. 3. Детектор находится внутри замкнутого контура, поэтому результат увеличения количества циклов можно получить за одно измерение. Увеличивая количество циклов, видим увеличение разрешения пиков с соответствующим уменьшением высоты и увеличением ширины. Потребовалось семь циклов, прежде чем расширение пика стало критическим для повторения еще одного цикла. Используя альтернативный метод с переключением колонок, можем наблюдать, что с каждым последующим циклом разрешение также увеличивается (рис. 4).
 |  |  |  |
После шести циклов получаем максимально возможное разрешение (1,29). Поскольку ширина пика достигает объема колонки, разрешение не может быть увеличено. Сравнение разрешения показано на рис. 5, где видно, что для максимального разрешения 1,13, достигнутого с помощью рециркуляции, потребовалось на три цикла меньше, чем с переключением колонок. Последний метод помог достичь максимального разрешения 1,29. Как и ожидалось, площади пиков для каждого цикла остаются неизменными, в то же время ширина пиков увеличивается. Во время процедуры по двум разным методам переработки ни один образец не был утрачен (рис. 6).
Оба метода подтверждают, что с помощью рециркуляционной хроматографии можно проводить сложные разделения.
Преимущества и недостатки классического метода рециркуляционной хроматографии
Метод рециркуляции через насос выигрывает в том, что конфигурация прибора достаточно проста. Разрабатывать метод тоже не сложно, потому что процесс можно контролировать в режиме онлайн с помощью детектора. Благодаря замкнутому циклу имеем низкое потребление растворителя. Основным недостатком рециркуляции через насос является большой мертвый объем, который увеличивают любая трубка до и после колонки, головка насоса внутри или камера смешивания, а затем вещества частично перемешиваются после выхода из стационарной фазы, и происходит быстрое расширение пика. Кроме того, насос и система подачи элюента загрязняются образцом – в зависимости от назначения это может быть серьезным недостатком.
Особенности метода с использованием крана переключения колонок
По сравнению с классическим подходом к рециркуляции через насос метод с использованием крана переключения колонок устраняет некоторые из недостатков, упомянутых выше. В частности, образец никогда не контактирует непосредственно с системой подачи элюента, поэтому можно избежать его загрязнения. Мертвый объем значительно меньше, поскольку учитываются только капилляры между входами и выходами колонки и мертвый объем клапана рециркуляции. Следовательно, расширение пика происходит не так быстро с увеличением количества циклов, как по методу циклической перекачки через насос. Соответственно, и разрешение целевых пиков растет быстрее. В приведенном примере такого же разрешения можно достичь на три цикла раньше, что помогает сократить общее время выполнения. Одним из недостатков метода поочередной перекачки является необходимость второй колонки и клапана – это усложняет устройство. Процесс нелегко контролировать в режиме онлайн, поскольку детектор обычно находится вне контура рециркуляции. Однако метод альтернативной прокачки показывает лучшее разрешение относительно целевых веществ, поэтому более подходит для разделения образца.
Обращайтесь к ХЛР, официальному поставщику жидкостных хроматографов KNAUER на территории Украины, и наши специалисты помогут сделать Ваш хроматографический анализ еще более удобным и совершенным.
По материалам компании KNAUER