Методы выявления и подсчета бактерий семейства Enterobacteriaceae в пищевых продуктах прописаны в приказе №548 «Об утверждении микробиологических критериев для установления показателей безопасности пищевых продуктов». Вспомним виды семейства, их значение, культуральные и биохимические свойства и два метода подсчета, которые внесены в вышеупомянутый приказ как референсные.
Представители семейства и их значение
К семейству Eterobacteriaceae принадлежит довольно много видов бактерий, среди которых:
- Salmonella
- Escherichia
- Klebsiella
- Shigella
- Proteus
- Enterobacter
- Serratia
- Citrobacter
Представители этих видов имеют санитарно-показательное значение для производителей продуктов питания как составная часть флоры кишечника человека и теплокровных животных. Используются в качестве ключевых индикаторных микроорганизмов, чтобы определить наличие более вирулентных и патогенных бактерий. Представителей этого семейства используют также для индикации недостаточной производственной гигиены, нарушений процессов производства или выявления загрязненных вспомогательных материалов.
Где искать?
- Туши крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, свиней
- Сухое молоко и сухая сыворотка
- Мороженое и замороженные молочные десерты
Исследуются эти продукты согласно ISO 21528-2. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальные методы обнаружения и подсчета бактерий Enterobacteriaceae. Часть 2. Подсчет колоний.
Также Enterobacteriaceae ищут:
- В сухих смесях для детей младшего возраста
- Сухих смесях для детей грудного возраста
- Сухих диетических пищевых продуктах для специальных медицинских целей, предназначенных для детей грудного возраста (младше шести месяцев)
- Пастеризованном молоке и других пастеризованных жидких молочных продуктах
В этой продукции Enterobacteriaceae определяется согласно ISO 21528-1. Горизонтальный метод выявления и подсчета бактерий Enterobacteriaceae. Часть 1. Выявление и учет методом НВЧ с предварительным обогащением.
Определение Enterobacteriaceae согласно ISO 21528-2
Согласно этому методу проводится учет характерных колоний, резвившихся за 24 ч при 37 °С * в VRBG-агаре, с последующим испытанием на ферментацию глюкозы и оксидазную активность. Данный метод рекомендуется, когда допустимая обсемененность образца превышает 100 КОЕ/мл или 100 КОЕ\г.
* Температура 37 °C, как правило, используется, когда Enterobacteriaceae рассматривается как гигиенический индикатор. В качестве альтернативы может быть выбрана температура 30 °С, когда подсчет Enterobacteriaceae проводится для технологических целей и включает в себя психротропные Enterobacteriaceae.
Схема посева и подсчета
1. Посев на VRBG-агаре:
Внести в стерильную чашку Петри 1 мл образца или первичного разведения, повторить со следующими десятикратными разведениями.
- Влить VRBG-агар соответствующей температуры
- После гомогенизации налить второй слой среды
- Инкубировать при 37 °С 24 ±2 ч
2. Отбор та подсчет колоний.
Характерные колонии на VRBG-агаре имеют цвет от розового до фиолетового с или без зоны преципитации
- Подсчитать типичные колонии на VRBG-агаре
- Отобрать 5 колоний (если типичных колоний менее 5 – отобрать все, если типичных колоний нет, отобрать беловатые)
3. Пересев и биохимическое подтверждение.
- Посеять каждую типичную колонию на чашки с питательным агаром с натрия хлоридом
- Инкубировать при 37 °С 24±2 ч
- Провести биохимическое подтверждение: отобрать изолированные колонии
- Провести тест на оксидазу с помощью тест-полосок
- Провести тест на ферментацию глюкозы:
- С изолированных колоний сделать посев уколом в пробирку с глюкозным агаром
- Инкубировать при 37 °С 24±2 ч
- Пожелтение колонки агара свидетельствует о ферментации глюкозы
Оформление результатов
Все колонии, которые имеют характерный рост на VRBG-агаре, оксидаза-отрицательные и ферментируют глюкозу, считаются представителями семейства Enterobacteriaceae. Результат представляют в количестве энтеробактерий в г или мл образца.
Определение Enterobacteriaceae согласно ISO 21528-1
Этот стандарт описывает обнаружение и подсчет энтеробактерий методом наиболее вероятного числа. Используется при допустимом обсеменении до 100 КОЕ в г или мл продукта.
В методе используется предварительное обогащение, а все этапы подтверждения совпадают с методом выявления, но используется несколько повторов (чаще 3). Количество колониеобразующих единиц определяется по таблицам НВЧ, представленным в стандарте ISO 7218.
Метод выявления
1. Неселективное обогащение
- Необходимое количество образца (в соответствии с порогом обнаружения) внести в среду неселективного обогащения – воду пептонную буферную
- Инкубировать при 37 °С 18±2 ч
2. Селективное обогащение
- Перенести 1 мл из среды неселективного обогащения в 10 мл обогатительной среды – ЕЕ бульон
- Инкубация 37° С 24±2 ч
3. Выделение и отбор для подтверждения
- Посев петлей из пробирки с обогатительным бульоном на поверхность VRBG-агара
- Инкубация 37° С 24±2 ч
3. Пересев и биохимическое подтверждение
- Посеять каждую типичную колонию на чашки с питательным агаром с натрия хлоридом
- Инкубировать при 37 °С 24±2 ч
- Провести биохимическое подтверждение: отобрать изолированные колонии
- Провести тест на оксидазу с помощью тест-полосок
- Провести тест на ферментацию глюкозы:
- С изолированных колоний сделать посев уколом в пробирку с глюкозным агаром
- Инкубировать при 37 °С 24±2 ч
- Пожелтение колонки агара свидетельствует о ферментации глюкозы
Оформление результатов
Все колонии, которые имеют характерный рост на VRBG-агаре, оксидаза-отрицательные и ферментируют глюкозу, считаются представителями семейства Enterobacteriaceae.
Результат представляют в присутствии или отсутствии энтеробактерий в соответствующем объеме или массе образца, в зависимости от посевной дозы.
Надеемся, из статьи Вы получили исчерпывающую информацию о референсных методах обнаружения Enterobacteriaceae. Для внедрения методики пользуйтесь непосредственно стандартом.
Анна Журба,
специалист отдела расходных материалов
ООО «ХИМЛАБОРРЕАКТИВ»