Законодательная база
- Методы выявления и подсчета коагулазоположительных стафилококков в пищевых продуктах прописаны в Наказі №548 «Про затвердження Мікробіологічних критеріїв для встановлення показників безпечності харчових продуктів». В приказ внесены два метода подсчета, которые определены как референсные.
- Также эти методы должны использоваться в арбитражных исследованиях всех пищевых продуктов согласно Наказу №397 «Про затвердження Переліку референс-методик відбору зразків та їх досліджень (випробувань), що повинні застосовуватись в арбітражних дослідженнях об’єктів санітарних заходів».
Названия методов
- ISO 6888-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium
- Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод підрахування коагулазопозитивних стафілококів (Staphylococcus aureus та інших видів). Частина 1. Метод з використанням агарового середовища Беард-Паркера
- ISO 6888-2:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 2: Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium
- Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод підрахування коагулазопозитивних стафілококів (Staphylococcus aureus та інших видів). Частина 2. Метод з використанням фібриногену плазми крові кролика для агарового середовища
Определение понятия «коагулазоположительные стафилококки» согласно ISO 6888-1:1999
Грамположительные, каталазоположительные микроорганизмы, которые образуют типичные и/или атипичные колонии на (в) селективно-диагностической питательной среде, дают положительную реакцию на коагулазную или специфическую для кроличьей плазмы реакцию на агаре с кроличьей плазмой и фибриногеном.
Значение для санконтроля
Стафилококк имеет большое значение для санитарного контроля пищевого производства из-за его распространения на коже и на слизистых верхних дыхательных путей человека. То есть он является индикаторным микроорганизмом для определения наличия более вирулентных и патогенных бактерий, передающихся контактно-бытовым и аэрозольным путем. Также он производит энтеротоксин, который является ключевой причиной пищевых отравлений. Находят его чаще всего в сыром молоке и в пищевых продуктах, изготовленных вручную.
Где искать?
- Сыры, изготовленные из сырого молока
- Сыры, произведенные из молока, которое подвергалось термической обработке при температуре ниже температуры пастеризации, и созревшие сыры, изготовленные из молока или сыворотки, прошедших пастеризацию или термическую обработку с высшей температурой
- Недозревшие мягкие сыры (свежие сыры), изготовленные из молока или сыворотки, прошедших пастеризацию или термическую обработку при высокой температуре
- Сухое молоко и сухая сыворотка
- Продукция из ракообразных и моллюсков, прошедших термическую обработку, без раковин, панциря и со снятыми створками
Выявление коагулазоположительных стафилококков согласно ISO 6888-1:1999
Согласно этому методу проводится учет характерных колоний, которые развились за 24–48 ч при 35–37 °С на агаре Байрд-Паркера, с последующим подтверждением реакции коагулазы.
Схема посева и подсчета
- Посев на агар Байрд-Паркера (к агару необходимо добавить эмульсию яичного желтка с теллуритом):
- Внести на поверхность 2 чашек Петри по 0,1 мл образца или первичного разведения, повторить со следующими десятикратными разведениями
- Если для некоторых продуктов нужно подсчитывать низкие количества коагулазоположительных стафилококков, обнаружение может быть поднято в 10 раз путем инокуляции 1,0 мл испытуемого образца, если он жидкий, или 1,0 мл первичного разведения для твердых продуктов путем посева на поверхность одной большой чашки с агаром (140 мм) или на поверхности трех маленьких (90 мм). В обоих случаях готовят повтор с помощью двух больших чашек или шести маленьких
- Инкубировать при 35 или 37 °С 24±2 ч с повторной инкубацией еще 24±2 ч
- Отбор и учет колоний.
- Характерные колонии на агаре Байрд-Паркера черные или серые, блестящие и выпуклые (от 1 мм до 1,5 мм в диаметре после инкубации в течение 24 ч и от 1,5 мм до 2,5 мм в диаметре после инкубации в течение 48 часов), окруженные четкой зоной, которая может быть частично непрозрачной. После инкубации в течение не менее 24 ч может появиться опалесцирующее кольцо в этой свободной зоне непосредственно в контакте с колониями. Подсчитать типичные колонии на агаре Байрд-Паркера.
- Отобрать 5 типичных колоний (если типичных колоний менее 5 – отобрать все, если типичных колоний нет, отобрать атипичные, если присутствуют типичные и атипичные, отобрать по 5 колоний всех типов)
- Подтверждение (коагулазный тест).
- Посеять каждую из отобранных колоний в пробирки с бульоном с сердечно-мозговым экстрактом.
- Инкубировать при 35 или 37 °С 24±2 ч
- Асептически внести 0,1 мл каждой культуры в стерильные пробирки с 0,3 мл кроличьей плазмы
- Инкубировать при 35 или 37 °C
- Оценить реакцию плазмы. Исследовать свертывание плазмы нужно при наклоне пробирки в интервале от 4-х до 6 ч инкубации и, если тест отрицательный, перепроверить через 24 ч инкубации или исследовать на время инкубации, заданное производителем. Считаем тест на коагулазу положительным, если объем сгустка занимает больше половины первоначального объема жидкости
Негативный контроль
Отрицательным контролем для каждой партии плазмы служит 0,1 мл стерильного бульона с сердечно-мозговым экстрактом, который прилагается к соответствующему объему плазмы и инкубируется без инокуляции. В контроле плазмы не должно быть никаких признаков свертывания.
Определение коагулазоположительных стафилококков согласно ISO 6888-2:1999
В этом методе также используется агар Байрд-Паркера. Но к нему добавляется фибриноген кроличьей плазмы, что позволяет сразу на чашке оценить коагулазную активность колоний. Она проявляется так же, как и протеазная и липазная активность, – зоной преципитации при добавлении яичной эмульсии.
Надеемся, из статьи Вы получили исчерпывающую информацию о референсных методах выявления коагулазоположительных стафилококков. Для внедрения методики пользуйтесь непосредственно стандартом.
Анна Журба,
специалист отдела расходных материалов
ООО «ХИМЛАБОРРЕАКТИВ»